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bob体育APP下载直销_聚丙烯酰胺凝胶电泳原理特性

聚丙烯酰胺凝胶电泳原理特性和sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理

聚丙烯酰胺

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide,简称acr)和交联剂又称为共聚体的n, n-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,简称bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶,以此凝胶为支撑物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳简称page)。与其他凝胶相比,聚丙烯酰胺凝胶有下列优点:①在一定浓度时,凝胶透明,有弹性,机械性能好。②化学性能稳定,与被分离物不起化学反应。③对ph和温度变化较稳定。④几乎无电渗作用,只要acr纯度高,操作条件一致,则样品分离重复性好。⑤样品不易扩散,且用量少,其灵敏度可达10-6g。⑥凝胶孔径可调节,根据被分离物的分子量选择合适的浓度,通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径。⑦分辨率高,尤其在不连续凝胶电泳中,集浓缩、分子筛和电荷效应为一体,因而有更高的分辨率。

page应用范围广,可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备,还可测定分子量、等电点等。

除了常用的聚丙烯酰胺圆盘及垂直板电泳,还有聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳、十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳及双向电泳等技术,这些技术在凝胶聚合方面有共同之处,但又有各自的特点,分别叙述如下。

一、聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性

1.聚合反应

聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel,pag)是由丙烯酰胺单体(acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(bis)在催化剂过硫酸铵或核黄素作用下聚合交联而成的三维网状结构凝胶,其单体及聚合物化学结构式如下图所示。

聚合反应时常用的催化剂有过硫酸铵及核黄素两个系统。在水溶液中,过硫酸胺离子s2o2-8可形成游离基so2-4,它能使丙烯酰胺单体的双键打开,形成游离基丙烯酰胺,后者和bis单体作用,能聚合成凝胶。

催化反应需要在碱性条件下进行,如用7%的丙烯酰胺,在ph8.3时,30min就能聚合完毕。为避免溶液中有氧气而妨碍聚合,在反应前有必要将溶液抽气除氧。核黄素在光照下部分分解并被还原成无色型核黄素;但在有氧的条件下此无色型又被氧化成为带有游离基的核黄素,后者也能使丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合成凝胶。为加速聚合,在合成过程中还加四甲基乙二胺(temed)作为加速剂促进聚合作用。

聚丙烯酰胺凝胶因富含酰胺基,使凝胶具有稳定的亲水性。它在水中无电离基团,不带电荷,几乎没有吸附及电渗作用,是一种比较理想的电泳支撑物。

2.凝胶孔径的可调性及其有关性质

(1)凝胶性能与总浓度及交联度的关系:凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和acr与bis之比。通常用t%表示总浓度,即100ml凝胶溶液中含有acr及bis的总克数。acr和bis的比例常用交联度c%表示,即交联剂bis占单体acr与bis总量的百分数。

根据有关实验研究,可知当t%值固定时,bis浓度在5%时孔径最小,高于或低于5%时,孔径却相应变大。为了在使用凝胶做实验时有较高的重现性,制备凝胶所用的acr浓度,bis和acr的比例、催化剂的浓度、聚合反应的溶液ph值、聚胶所需时间等能影响泳动率的因子都必须保持恒定。

要想将蛋白质或核酸之类的大分子混合物很好地分离,并在凝胶上形成明显的区带,选择一定孔径的凝胶是个关键。常用的标准凝胶是指浓度为7.5%的凝胶,大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳,能获得满意的结果。

(2)凝胶浓度与被分离物分子量的关系:由于凝胶浓度不同,平均孔径不同,能通过可移动颗粒的分子量也不同,其大致范围如表3-3。

在操作时,可根据被分离物的分子量大小选择所需凝胶的浓度范围。也可先选用7.5%凝胶(标准胶),因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得较满意的结果。

聚丙烯酰胺

表3-3分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度(%)蛋白质

<104

1-4 104

1-5 104-1 105

1 105

>5 10520-30

15-20

10-15

5-10

2-5核酸(rna)

<104

104-105

105-2 10615-20

5-10

2-2.6


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